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【ISCO 制備色譜儀】快速色譜法在簡單碳水化合物純化中的應(yīng)用

更新時間:2024-06-14       點擊次數(shù):858

01 摘要


碳水化合物化合物可利用 RediSep Gold Amine 色譜柱結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測(ELSD)進(jìn)行簡便的純化。該色譜柱采用親水相互作用液相色譜(HILIC)梯度洗脫法,以乙腈或丙酮與水的梯度進(jìn)行操作。將待純化的樣品溶解于 DMSO 中,不僅允許大量樣品加載,同時還能保持良好的分辨率。

【ISCO 制備色譜儀】快速色譜法在簡單碳水化合物純化中的應(yīng)用    

02 背景    


   

碳水化合物通常采用氨基柱進(jìn)行分析,該方法具有良好的分辨率。這種分析方法一般使用乙腈和水作為流動相,樣品通常溶解在水中。由于樣品注射量較小,樣品有機(jī)會吸附在固定相上。在制備色譜中,相對于色譜柱尺寸而言,樣品負(fù)載和注射體積要大得多,因此將樣品溶于水中注射會讓樣品引無法吸附在柱子上,然后在空隙處洗脫。干法加載樣品到固體裝載小柱上(由固體裝載小柱實施干法加載)常用于快速色譜,但用戶需要自己用氨基介質(zhì)填充他們的小柱。樣品仍然溶解在水中進(jìn)行加載,這需要很長時間才能在運行樣品前蒸發(fā)。


二甲基亞砜(DMSO)常用于反相色譜的樣品溶解,因為它能溶解大多數(shù)化合物。DMSO 能夠溶解碳水化合物,但在 HILIC 中是一種弱溶劑,因此它允許樣品吸附在柱子上。在使用氨基柱時,DMSO 洗脫早期被洗脫;然而,在采用非氨基介質(zhì)的其他 HILIC 運行中,它可能在梯度洗脫的后期才被洗脫。    


   

03 結(jié)果與討論    


   

雖然親水相互作用液相色譜(HILIC)屬于正相色譜,但它使用的溶劑通常適用于反相色譜,因此需要根據(jù)表 1 中的設(shè)置調(diào)整蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)的參數(shù),以保持基線穩(wěn)定的同時維持靈敏度。    


   

表1. 純化碳水化合物的蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)設(shè)置。    

ELSD控制                                    

設(shè)置值                                    

Spray Chamber

20℃

Drift Tube

60℃

Gain

1

Sensitivity

High



樣品均溶解于 DMSO 中。如有必要,將樣品在熱水浴中加熱以促進(jìn)溶解。使用 PeakTrak Flash Focus 梯度生成器在系統(tǒng)上開發(fā)方法。運行了一個亻貞查梯度以驗證樣品能夠被洗脫,并證明化合物之間有足夠的分辨率以實現(xiàn)成功的純化。化合物的滯留時間用于計算聚焦梯度的溶劑比例。 本文中所有運行 均使用 RediSep Gold® 氨基柱。運行完成后,用2-丙醇洗滌并儲存柱子,2-丙醇與有機(jī)溶劑混溶,可實現(xiàn) 快速純化低極性化合物。


第一個實例使用了核糖和葡萄糖。亻貞查梯度和聚焦梯度都使用乙腈作為弱溶劑。亻貞查運行只用了少量幾毫克,并且為了提高這個小樣品負(fù)載的靈敏度,ELSD 增益被調(diào)高到 3。第二個洗脫峰用于聚焦梯度;計算梯度后,ELSD 增益被重置為 1 以保持 ELSD 響應(yīng)在量程內(nèi)。本案例使用50克的RediSep Gold氨基管柱分離100毫克混和物。    


   

果糖和蔗糖通常一起出現(xiàn)在樣品中。圖 2 展示了從雜質(zhì)中純化果糖的過程。該混合物以與核糖-葡萄糖樣品類似的方式運行,但改採行梯度聚焦于葡萄糖。在約 1.8 柱體積(CV)出現(xiàn)的峰是用于溶解樣品的 DMSO。    


   

【ISCO 制備色譜儀】快速色譜法在簡單碳水化合物純化中的應(yīng)用    

圖1. 核糖和葡萄糖在 5.5 克 RediSep Gold Amine 柱上運行亻貞查方法(上圖),并聚焦到 50 克 RediSep Gold 胺柱上。樣品總負(fù)載量為核糖和葡萄糖各 50 毫克。聚焦梯度中約 1.8 柱體積處的小峰是 DMSO。    

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圖2. 使用 RediSep Gold Amine 柱和乙腈/水梯度從蔗糖中純化不純的果糖。


   

04 丙酮作為弱溶劑    


   

丙酮也是 HILIC 的弱溶劑,可以替代乙腈使用。盡管醇類可以用于 HILIC,但這些溶劑對于在胺柱上純化碳水化合物來說太強(qiáng)了。使用丙酮純化了一個果糖和葡萄糖的樣品。    


   

該混合物的純化方式與之前的例子相似,除了運行亻貞查梯度時使用了一根 15.5 克的 RediSep Gold Amine 柱,因為 PeakTrak 允許使用任何尺寸的 Teledyne ISCO 柱進(jìn)行亻貞查運行。聚焦梯度使用了一根 50 克的 RediSep Gold Amine 柱,但計算出的梯度需要較低的水濃度來純化葡萄糖,這表明對于這些化合物,丙酮是比乙腈更強(qiáng)的溶劑。    


   

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圖3. 使用丙酮/水梯度純化的果糖和蔗糖。亻貞查運行使用了一根 15.5 克的 RediSep Gold 胺柱。    


   

05 結(jié)論    

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使用PeakTrak Flash Focus Gradient Generator(梯度生成器)搭派上Teledyne ISCO的所有色譜管住,這可以幫助您迅速找出蕞適合洗脫條件,并提升純化量能。

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